一、液相色譜儀的結(jié)構(gòu)：
hplc的出現(xiàn)不過三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程也多種多樣。液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置(用雙泵)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。
1 、高壓泵
HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的(1——6mm)，所用固定相的粒度也非常小(幾μm到幾十μm)，所以流動(dòng)相在柱中流動(dòng)受到的阻力很大，在常壓下，流動(dòng)相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時(shí)。為了達(dá)到快速、分離，必須給流動(dòng)相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動(dòng)速度。為此，須用高壓泵進(jìn)行高壓輸液。高壓、高速是液相色譜的特點(diǎn)之一。
HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：
a 流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍(一般為1——10ml/min);
b 能抗溶劑腐蝕;
c 有較高的輸液壓力;對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對分離，要求達(dá)到150——300×105Pa。
(1)往復(fù)式柱塞泵
當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口(上部)的單向閥打開，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥(下部)關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。
(2)氣動(dòng)放大泵
其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動(dòng)大面積(SA )活塞A，則在小面積(SB )活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。
2 、梯度洗提
類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代液相色譜中*的部分。
梯度洗提，就是載液中含有兩種(或更多)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：
a 低壓梯度(也叫外梯度)：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺(tái)高壓泵輸入色譜柱。
b 高壓梯度 (或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) )：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。
3 、進(jìn)樣裝置
(1)注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與GC法一樣。進(jìn)樣壓力<150×105Pa，當(dāng)進(jìn)樣壓力>150×105Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。
(2)高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。
4、色譜柱
色譜柱是色譜儀重要的部件(心臟)。通常用后壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。
柱子內(nèi)徑一般為1——6mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4.6或3.9mm ，長度為15——30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5——10μm ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約7000——10000 。
發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。
5、檢測器
(1)紫外光度檢測器
它的作用原理是基于被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。是常用的檢測器，應(yīng)用廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。其特點(diǎn)是：
a 靈敏度高：其小檢測量10-9g·ml-1，故即使對紫外光吸收很弱的物質(zhì)，也可以檢測;
b 線性范圍寬;(比爾定律)
c 流通池可做的很小(1mm×10mm，容積8μl);
d 對流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫;
e 波長可選，易于操作：如，使用裝有流通池的可見紫外分光光度計(jì)(可變波長檢測器)。
缺點(diǎn)：對紫外光*不吸收的試樣不能檢測;同時(shí)溶劑的選擇受到限制。
(2)光電二極管陣列檢測器
紫外檢測器的重要進(jìn)展;陣列由1024個(gè)光電二極管陣列，每個(gè)光電二極管寬僅50μm，各檢測一窄段波長。如圖所示，在檢測器中，光源發(fā)出的紫外或可見光通過液相色譜流通池，在此流動(dòng)相中的各個(gè)組分進(jìn)行特征吸收，然后通過狹縫，進(jìn)入單色其進(jìn)行分光，后由光電二極管陣列檢測，得到各個(gè)組分的吸收信號。經(jīng)計(jì)算機(jī)快速處理，得三維立體譜圖。
(3)熒光檢測器
熒光檢測器是一種高靈敏度、高選擇性檢測器。對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。熒光檢測器的結(jié)構(gòu)及工作原理和熒光光度計(jì)相似。
(4)差示折光檢測器
除紫外檢測器之外應(yīng)用多的檢測器。差示折光檢測器是借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶液的折射率是純?nèi)軇?流動(dòng)相)和純?nèi)苜|(zhì)(試樣)折射率乘以各物質(zhì)的濃度之和。因此溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相之間折射率之差表示試樣在流動(dòng)相中的濃度。
(5)電導(dǎo)檢測器
其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測定電離物質(zhì)含量。
二、液相色譜儀的應(yīng)用實(shí)例
氣相色譜法與液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣虼瞬皇茉嚇訐]發(fā)性的限制。對于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%——80%)原則上都可應(yīng)用液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70——80%。